Validação de proteínas recombinantes da leishmania infantum e da saliva do lutzomyia longipalpis como biomarcadores para o sorodiagnóstico e avaliação da exposição às leishmanioses / Validation of recombinant proteins of Leishmania infantum and saliva of Lutzomyia longipalpis as biomarkers for serodiagnosis and assessment of exposure to leishmaniasis

O controle das populações de flebotomíneos, a contenção das epidemias nas fases iniciais e a facilitação do diagnóstico precoce dos indivíduos parasitados são estratégias traçadas pela OMS para a vigilância e controle da leishmaniose. Neste contexto, os testes sorológicos utilizando tanto o sonicado de glândula salivar (SGS) dos flebotomíneos quanto o antígeno solúvel de Leishmania (SLA) são importantes ferramentas para o controle/diagnóstico das Leishmanioses. No entanto, os testes realizados a partir da utilização de antígenos obtidos de frações brutas, apesar de apresentarem alta sensibilidade, alguns destes antígenos apresentam reação cruzada com epítopos compartilhados por outros patógenos/vetores. Além disso, o preparo dos antígenos não tem adequada reprodutibilidade devido a grande dificuldade de obtenção e/ou padronização destes. No presente trabalho, objetivamos identificar biomarcadores para a vigilância e o controle das Leishmanioses, utilizando proteínas recombinantes da saliva dos flebotomíneos como biomarcadores de exposição ao vetor e proteínas recombinantes da Leishmania para obtenção de um diagnóstico sorológico mais preciso para a Leishmaniose Tegumentar humana. Numa primeira etapa, foram realizados testes imunoenzimáticos contra as proteínas recombinante da saliva do vetor L. longipalpis (rLJM11 e rLJM17) para estimar a positividade anti-saliva num pequeno número de soros de crianças de uma área endêmica para Leishmaniose Visceral. Foi observado que os soros que reconhecem o SGS do L. longipalpis também reconhecem em diferentes proporções as proteínas rLJM17 e rLJM11. Ademais, as proteína recombinantes foram capazes de detectar a soroconversão anti-saliva de soros de uma segunda área endêmica para LV, havendo aumento no reconhecimento quando utilizadas as duas proteínas recombinantes de forma combinada. Além disso, a análise das curvas ROC evidenciou o desempenho superior da combinação das proteínas rLJM17 + rLJM11. Estes dados foram confirmados com a avaliação das proteínas frente um grande painel de 1.077 amostras de soro de indivíduos de uma outra área endêmica para LV. Nesta etapa, nossos resultados indicam que as proteínas rLJM11+rLJM17 representam uma ferramenta epidemiológica promissora que pode auxiliar na implementação de medidas de controle contra a Leishmaniose Visceral. Numa segunda etapa, testes imunoenzimáticos foram realizados contra uma série de proteínas recombinantes da Leishmania (HSP70, H2A, H2B, H3, H4 e KMP11) a fim de selecionarmos proteínas antigênicas contra soros de pacientes com Leishmaniose Cutânea (LC) e Leishmaniose Mucosa (LM) e que apresentassem elevada especificidade quando testadas contra soros de indivíduos com outras patologias (doença de Chagas, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Hanseníase e Tuberculose). Para avaliar a eficácia das proteínas recombinantes foram utilizadas curvas ROC, possibilitando a seleção de antígenos possivelmente mais eficientes que o SLA no imunodiagnóstico da Leishmaniose. As proteínas recombinantes HSP70 e H2A foram selecionadas por apresentarem elevada sensibilidade, sendo reconhecida por anticorpos dos soros de pacientes com LM e LC respectivamente. Na última etapa dos experimentos, utilizando soros de indivíduos que apresentavam outras patologias, observou-se que a reação cruzada diminui frente aos antígenos recombinantes, especialmente para a rHSP70, quando comparamos à observada para o SLA. Nossos resultados mostram a elevada antigenicidade da rHSP70, sugerindo a possibilidade de utilização desta proteína recombinante para o sorodiagnóstico da Leishmaniose Tegumentar. Neste trabalho foi possível identificar e validar o uso de proteínas recombinantes do parasito e da saliva dos flebotomíneos como biomarcadores para o sorodiagnóstico e avaliação da exposição às leishmanioses.

Influência de diferentes condições de armazenamento sobcongelamento na reatividade de anticorpos séricos / Influence of different freezing storage conditions on the the reactivity of serum antibodies

Anticorpos, importantes marcadores sorológicos usados rotineiramente no imunodiagnóstico para caracterizar diversas doenças, possuem uma estrutura quaternária crucial no reconhecimento antigênico e na reação imunológica. A estocagem de amostrasde soro é um fator determinante na alteração da estrutura química dessas glicoproteínas. A estabilidade de amostras soropositivas para a doença de Chagas (DC), Toxoplasmose e Streptoccocidiose foi avaliada após estocá-las em diferentes temperaturasde congelamento (-8ºC e -20ºC) e a -20°C em freezer tipo Frost-free (FF) poraferição dos títulos sorológicos em períodos de tempo (0, 60 e 90 dias), testando as reatividades por Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) e hemaglutinação HAI para DC, ELISA e imunofluorescência indireta (IFI) para toxoplasmose, e aglutinação enefelometria para anticorpo antiestreptolisina O (ASLO). O armazenamento em FF mostrouser a melhor condição para conservar amostras para análises por HAI para DC, por IFI para toxoplasmose e por nefelometria (ASLO). As análises por ELISA para DC e toxoplasmose e as de ASLO (aglutinação) mostraram uma alta redução de reatividade quando comparadas àquelas estocadas a -8ºC e -20ºC. Isto pode indicar heterogeneidade entre grupos de anticorpos e/ou possíveis diferenças de especificidade nos métodos dediagnóstico utilizados.